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《2014年中国作物学会学术年会论文集》2014年
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巴西橡胶树单染色体的显微分离及体外扩增

姚宇飞  王英  高和琼  庄南生  
【摘要】:巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)是一种重要的产胶植物,也是热带、亚热带地区的重要经济作物。国内外研究者先后从橡胶树cDNA文库或其总基因组中克隆获得了近420种基因或cDNA,不仅工作量大而且无法确定其在橡胶树染色体上的位置和分布特点。利用分子标记技术构建的橡胶树连锁遗传图饱和度也不够,许多功能基因在染色体组上的连锁关系和位置都不清楚,直接利用分子标记辅助橡胶树育种难度较大。开展巴西橡胶树单染色体显微分离及体外PCR扩增,进而进行单染色体高通量测序及序列分析与功能注释,可有效解决上述问题。本实验以巴西橡胶树热研7-33-97的古铜期嫩叶为材料,采用课题组成员所建立与完善的橡胶树单染色体微分离技术体系进行其染色体分离,并采用单细胞全基因组扩增方法来代替原有的LA-PCR法进行单染色体体外扩增。结果表明,单细胞全基因组扩增技术可从微量样本(巴西橡胶树单条染色体)中进行高度均一的全基因组扩增,其核心技术为多次退火环状循环扩增(MALBAC)技术,即利用独特的具有链置换活性的DNA聚合酶进行准线性的全基因组预扩增,通过PCR进行指数式扩增,为下游分析提供充分的实验材料。应用此扩增技术对热研7-33-97多条不同的单条染色体进行体外PCR扩增,平均获得范围在300-2000bp之间的扩增产物10μg,耗时4小时左右,中间产物无需纯化。与LA-PCR相比该技术具有操作简便、污染几率小、耗时短、扩增产物多、成功率高等优点,并可在AT-GC富集区得到准确、高重复度的连续扩增结果,适用于多个分析平台及下游研究,可为后续的荧光原位杂交、高通量测序分析提供较优质充分的实验材料,并为筛选橡胶树染色体特异片段、单染色体或其区段的特异探针或特异标记,为构建橡胶树单条染色体高密度分子标记连锁图谱、功能基因的分离和克隆定位及基因组物理图谱构建奠定基础。

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