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《2005年全国作物遗传育种学术研讨会暨中国作物学会分子育种分会成立大会论文集(一)》2005年
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基于小麦成熟胚培养的农杆菌转化研究

王艳丽  叶兴国  王道文  
【摘要】:自 Vasil 等1993年利用基因枪介导法、Cheng 等1997年利用农杆菌介导法首次获得小麦转基因植株以来,小麦转基因技术日趋成熟,研究重点已经从利用标记基因、报告基因建立小麦转化体系,过渡到了利用功能基因转化改良小麦重要经济性状方面。纵观基于再生途径的小麦转基因研究,起始外植体材料均利用了其未成熟幼胚。以幼胚为受体的转化体系受季节的限制,取材很不方便,不但需要精细的种植管理和适宜的生长条件,而且需要掌握合适的取材时期。小麦成熟胚再生体系可以克服上述诸方面的缺点目前为止,虽然就小麦成熟胚再生问题开展了一些研究,但还没有利用小麦成熟胚为受体材料获得转基因植株的报道。本研究选用了西农222、兰考906、丰抗8号、轮选208、扬麦6号和 Bobwhite 等6个小麦基因型,成熟种子消毒后在无菌水中浸泡过夜。次日在无菌条件下对成熟胚采用5种处理方法:①将成熟胚刮碎,接种在 MSB 培养基上诱导愈伤组织,培养7~10d 用于农杆菌侵染;②将成熟胚纵切成两半直接被农杆菌侵染;③成熟胚剥离胚乳后直接被农杆菌侵染;④将成熟胚剥离胚乳,直接接受农杆菌的侵染,共培养后切碎转到恢复培养基上;⑤将成熟胚刮碎,接种在 N6上诱导愈伤组织。用含有 pPNT290载体(其中的 GUS 基因由 Ubiqutin 启动子调控,nptⅡ基因由35S 启动子调控)和 pBI121-WT 载体、pBI121-154Y 载体(除携带 nptⅡ基因由 NOS 启动子调控,分别携带由35S 启动子调控的来自于山羊草的高分子量谷蛋白亚基基因 WT 和154Y)的 c58Cl 农杆菌菌系室温下感染小麦成熟胚组织15 min,感染后的受体材料到无菌滤纸上黑暗条件下共培养2d,组织化学染色检测部分受体组织中 GUS 基因瞬时表达,其余受体组织进一步恢复、筛选和再生。结果表明,就基因型而言,兰考906成熟胚对农杆菌感染最为敏感,三种处理方式后的愈伤组织中都观察到了 GUS 基因表达,表达率分别达到了3.3%、64.9%、94.4%,均分别高于其它基因型。就处理方式来说,成熟种子浸泡后直接纵向切开更有利于农杆菌感染,但兰考906以成熟胚切碎后在含 AS 的 N6培养基上预培养7d 为最高。经过筛选分化共获得了83株抗 G418筛选剂的再生植株,移栽成活51株。根据 nptⅡ基因设计引物,对全部移栽成活的 T0代抗筛选剂再生植株进行了 PCR 检测,获得了20株阳性植株,其中有3株 nptⅡ ELISA 检测呈现阳性,表明外源基因已经整到了小麦基因组中并已正常表达。进一步对其中2个 T1代株系进行了 PCR 检测,其中一个株系出苗17株,PCR 检测了10株,9株呈阳性。另一个株系出苗5株,PCR 检测2株阳性,表明 nptⅡ基因已经由 T0代稳定遗传到了 T1代。建立小麦成熟胚为受体的遗传转化体系, 对于促进小麦转基因研究具有重要意义。下一步,我们将对转基因植株进行 Southem 检测和功能鉴定。

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